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糖蛋白研究新工具-人凝集素芯片

2016/08/01

 

     

      蛋白质糖基化是目前已知的最为复杂和广泛的蛋白翻译后修饰,其中最具代表性的就是血清蛋白的糖基化。根据前期研究报道,糖基化修饰异常与包括癌症在内的广泛疾病存在相关性。近日,华盈生物的合作伙伴——上海交通大学陶生策教授课题组构建了首张人凝集素芯片,成为替代植物凝集素芯片的新型糖蛋白研究工具。相关研究成果7月发表在蛋白质组学领域专业国际期刊Molecular & Cellular Proteomics上PMID:27364157)。

        截止到目前,高效的糖基化分析研究多采用凝集素芯片,而现有芯片上点制的凝集素多取自于植物凝集素,对于人类样品中复杂糖蛋白的分析存在困难。人体中也存在凝集素或类凝集素蛋白质,大多数是整合在细胞膜上的跨膜蛋白质,也有部分是可溶性蛋白质和分泌蛋白质。由于是人类细胞的内源蛋白,这些人凝集素蛋白对于人类样品中的糖蛋白糖链的结合力和分辨率更高。据此,上海交通大学的陶生策研究组,挑选并克隆出60种人类凝集素和类凝集素基因,通过酵母系统进行凝集素全长蛋白的表达,构建出了世界上第一张人凝集素蛋白芯片。



                                                                  图1. 人类凝集素芯片的制备及应用流程图


人凝集素芯片的制备和质控


        研究人员通过Gateway系统的LR反应构建出人凝集素克隆表达质粒,将其转入酿酒酵母菌株中进行蛋白的表达纯化,得到高质量的带GST标签的重组凝集素目的蛋白。
        银染结果表明:大多数纯化的重组凝集素和类凝集素的大小与预期一致,表达量高且条带清晰,适于制备凝集素芯片(如图2)。



                                                                       图2.  重组凝集素和类凝集素的纯化


        随后,研究人员按照每张芯片12个Block,每种蛋白设置3次技术重复的形式将人凝集素固定在芯片片基上,形成了最终的凝集素芯片。为鉴定芯片质量,研究人员采用抗GST的抗体对芯片进行质检,质检结果符合要求(如图3)。

 


                                                                       图3.  人类凝集素芯片的质控扫描图


人凝集素芯片的应用可行性评价


        进一步,研究人员将分别用荧光标记的THP-1细胞裂解液以及经PNGase酶处理(去除糖蛋白N-链接糖基化)的THP-1细胞裂解液分别与凝集素芯片进行孵育反应。对芯片进行荧光扫描,并系统性分析芯片数据后发现:THP-1细胞裂解液中的糖蛋白与人凝集素芯片上26种重组凝集素蛋白有结合。并且,经PNGase处理后,这26种凝集素捕获的信号值均显著降低(如图4),说明该研究构建的人凝集素芯片对于糖蛋白糖链检测具有足够的敏感性,可用于生物样本的糖基化差异分析。

                                  


                                                                                                   图4. 人凝集素活性验证

 

凝集素芯片应用—精子表面糖基化研究


        研究人员利用人凝集素芯片对精子表面的糖基化进行了筛选。发现了5种凝集素(GalNac-T6, galectin-1, ERGIC-53, galectin-8 和 galectin-7)与精子表面糖蛋白显著结合。其中, Galectin-8信号最强(如图5)。


       

     


                                                                              图5.  5种凝集素与精子高度结合


        进一步,通过流式细胞分析及免疫荧光验证,发现这几种凝集素与精子细胞表面结合的位置不同。如:Galectin-8与精子的全长均强烈结合,而ERGIC-53仅仅与精子头部和颈部结合(如图6)。

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                                                                            图6.  精子表面糖蛋白的不同分布

质谱鉴定Galectin-1结合精子蛋白


        利用重组凝集素蛋白Galectin-1与精子膜蛋白进行pull down实验,将其结合的糖蛋白进行质谱分析,发现Galectin-1能够捕获精子上的多种膜相关蛋白质,其中就包括两种热休克蛋白:HSP90和HSP70(如图7)。


                                                             图7.  LC-MS分析鉴定Galectin-1结合膜相关蛋白


糖蛋白研究案例拓展—癌症标志物研究


        糖基化修饰在细胞膜和血清蛋白中的比例非常高,是否糖基化以及糖基化程度与疾病的发生和发展密切相关。因此,进行不同疾病血清或组织样本中蛋白糖基化的筛选往往成为发现特异生物标志物的有效途径。

        近日,复旦大学顾建新教授研究组就开展一次大规模血清蛋白糖基化的研究项目,评估了12种癌症类型与非恶性对照中IgG糖基化的修饰的调变情况,发现IgG蛋白的半乳糖比值(Gal-ratio)差异可以显著区分多种癌与对照样本,与经典标志物联合应用更能够显著提高其诊断效力。该研究成果发表在7月的Cell Research杂志上(PMID:27364686)。

        研究人员利用收集自多家医院的大量样本评估了在12种癌症类型中IgG半乳糖基化的分布情况,在两个独立的组群中证实IgG半乳糖比值(Gal-ratio)显示出共同的特征。分析IgG半乳糖比值可以将这12种癌症类型与非癌性对照显著区分开来。当采用IgG半乳糖比值来区分早期阶段癌症与非癌性对照时也获得了相似的结果(如图8)。

                             


                                                       图8 .  IgG的Gal-ratio可以作为特异生物标志物   

                                                                          


        上述结果表明,IgG半乳糖基化比例有潜力作为一种非侵袭性的泛癌症生物标志物,用于早期癌症检测和癌症筛查。

        综上,作为一种广泛存在的蛋白质修饰,糖基化研究一直为生物医学领域科学家所关注。但受到分析方法和分析工具的限制,糖基化研究的进展相对其它研究更为缓慢。人类凝集素蛋白芯片的诞生将会为蛋白糖基化研究增添新的动力。

       
上海华盈生物医药科技有限公司位于上海张江高科技园区,是医学生物技术领域的特色高科技企业。与Full Moon、Raybiotech、CDI、Bio-Rad、R&D等多个主流蛋白芯片国际专业公司结成战略合作伙伴关系。引进和开发了多个蛋白与抗体芯片检测平台和系列产品,包括凝集素芯片、Luminex液相悬浮芯片、人类19394种蛋白质组芯片、信号通路磷酸化抗体芯片、蛋白表达抗体芯片和蛋白质谱等先进的蛋白高通量研究技术,全力打造蛋白质研究的“一站式”科研服务体系。‍
       
        华盈生物团队致力于通过蛋白芯片技术开发的不断深入,为蛋白质研究和转化医学研究领域的科学家提供最优秀的研究工具和研究策略,努力成为广大科研工作者最值得信赖的科研伙伴。期待与您更进一步的交流与合作!


        英文文献链接:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27364157
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=PMID%3A+27364686