文献赏析

小样本量的血浆来源外泌体如何开展机制研究?

2021/05/25

随着外泌体研究热度的逐渐升温,很多临床医生都希望在自己的业务领域中也能够利用外泌体做一些基础研究。然而,受到临床样本资源和经费的限制,往往美好的想法到具体落实的时候总觉得心有余而力不足。对于临床医生来讲,最容易获得的临床样本就是各种各样的体液,包括:血浆、腹水、胸水、尿液、唾液等,外泌体又几乎存在于所有体液中。体液中的外泌体包含的载运蛋白、核酸等功能性分子又可靶向特定的组织,参与细胞间通讯,组织微环境的重构等生理和病理过程。外泌体的这些独特的特点正好解决了临床医生在基础科研路上的关键难题。那么,如何利用相对而言易于获取的体液样本开展比较深入的机制研究呢?尤其在样本数量不多,经费受限的情况下开展此类研究,成为很多粉丝经常问到华盈视角小编的问题。

今天,华盈视角将通过一个精彩的案例的分享,帮粉丝们揭开利用血浆收集的外泌体开展疾病机制研究的具体思路。希望通过我们的分享,能够帮助更多的临床医生朋友顺利开展外泌体相关的机制研究,扫除科研路上的拦路虎。



  



血浆外泌体保护心肌缺血再灌注损伤

此案例是发表于心血管领域的顶刊J Am Coll Cardiol杂志 (IF=20.589)的一篇代表性文章。具体的研究内容如下:

动物实验证明血浆外泌体的心肌保护作用

1. 再灌注损伤的大鼠模型尾端静脉注射正常鼠血浆外泌体(Control exosomes)、远端缺血预处理(RIC)的大鼠血浆外泌体(RIC exosomes),发现不管是正常鼠还是RIC大鼠的血浆外泌体都能减少心肌再灌注损伤的程度(图1A);
(RIC可以让心脏处于受保护的状态,免受再灌注损伤)


2. 大鼠心肌细胞缺氧复氧模型模拟缺血再灌注损伤,然后再用大鼠血浆外泌体处理损伤的细胞,可以显著降低细胞死亡,作用效果和外泌体浓度呈现依赖性(图1B)。该动物实验说明血浆外泌体可以保护再灌注对心肌的损伤。                                             23e017cba9b9e495b7a43ee59803b93.png


图1.血浆外泌体保护心肌免受再灌注损伤

收集临床血浆外泌体

1. 收集来自6个健康人的总共60ml血液,分离的血浆用来提取血浆外泌体(Control exosomes);
2. 6个健康人经过RIC后,再次收集血浆外泌体(RIC exosomes);
3. NTA分析发现RIC可以显著增加血浆中外泌体的浓度,但粒径大小不会改变(图2)。


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图2. RIC增加血浆外泌体的浓度

血浆外泌体保护心肌免受损伤的机制研究


1. 血浆外泌体激活参与心肌保护的几个重要的相关激酶

(1) 大鼠和人的血浆外泌体处理大鼠心肌细胞,都可以激活p-ERK1/2,但是和胰岛素处理相比,血浆外泌体不能激活p-AKT,说明血浆外泌体不会激活胰岛素信号通路(图3A)。

(2) 人的血浆外泌体处理损伤细胞模型,可以显著降低细胞死亡,但是加入ERK1/2的抑制剂U0126和D98059后,血浆外泌体的作用消失,说明血浆外泌体对心肌细胞的作用依赖于心肌细胞中ERK1/2的活性(图3B)。

(3)血浆外泌体还可以激活ERK1/2下游的另外一个心肌保护的重要蛋白HSP27(图3C)。

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图3. 血浆外泌体激活心肌细胞内的相关蛋白
2. 血浆外泌体怎样激活心肌细胞内的相关蛋白?
(1) 前期的研究发现了HSP70是一个重要的心脏保护蛋白,HSP70是一个损伤相关的模式分子,可以结合TLR4受体发挥作用激活下游的分子。并且RIC可以显著增加体内循环HSP70的浓度。为了证实HSP70存在与外泌体中,研究者通过流式技术发现了HSP70表达在人的血浆外泌体膜上,并且通过一个识别HSP70膜形式的抗体cmHsp70.1验证了HSP70可以表达在血浆外泌体的膜上,而RIC可以显著增加血浆外泌体中HSP70的表达。最后,通过免疫胶体金电镜也证实了HSP70存在于血浆外泌体的膜上的事实(图4)。

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图4. RIC增加血浆外泌体膜上HSP70的表达


(2) 为了证实血浆外泌体通过膜上的HSP70激活心肌细胞内的相关蛋白,外泌体预先和cmHsp70.1抗体孵育,中和部分HSP70,之后再处理心肌细胞。结果发现,中和HSP70的外泌体对ERK1/2和HSP27的激活作用减弱,保护损伤细胞免受死亡的作用消失,说明了外泌体依靠膜上的HSP70发挥作用(图5A,B)。    

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图5. 血浆外泌体激活心肌细胞内的HSP70-TLR4-ERK1/2-p38MAPK-HSP27信号级联

(3) 利用TLR4的抑制剂TAK-242处理细胞,发现血浆外泌体激活ERK1/2和HSP27的作用也减弱,说明外泌体执行功能依赖与HSP70和TLR4相互结合。HSP27上游重要的激酶是p38MAPK,利用p38MAPK的抑制剂SB203580处理细胞,发现血浆外泌体不再激活HSP27,但是可以激活ERK1/2,说明p38MAPK位于ERK1/2的下游,HSP27的上游(图5C)。最后分别利用这些抑制剂和血浆外泌体同时处理损伤的细胞,发现血浆外泌体保护损伤细胞免受死亡的作用消失(图5D)。综上实验,说明了血浆外泌体对心肌细胞保护作用通过促进HSP70-TLR4-ERK1/2-p38MAPK-HSP27这条信号通路的激活发挥的(图6)。


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图6.血浆外泌体保护心肌损伤的机制模拟图


华盈视角

本文值得借鉴的设计亮点:
1. 将先前的相关研究成果通过外泌体整合在了一起
2. 通过分离血浆外泌体进行功能实验
3. 将动物来源的血浆外泌体和临床样本来源的血浆外泌体联合分析
4. 如何发现外泌体功能分子并进行结构定位
5. 如何将外泌体功能蛋白与经典细胞信号通路进行链接     

小结与拓展


这篇文章将临床样本来源的血浆外泌体与动物模型和细胞模型结合开展功能实验,非常新颖,特别适合临床上小样本的外泌体研究。同时,华盈视角也总结了该类研究的几个关键技术点供粉丝们参考:

1. 关于外泌体功能分子的筛选方案:此案例基于文献调研和研究背景发现了外泌体的功能蛋白,其实这样的筛选风险很大。推荐的技术路线应该是基于组学技术筛选差异分子,结合文献和数据库等进行验证更为稳妥。但是,对于血浆提取外泌体来说,常规的超速离心获得的外泌体纯度并不高,会引入血浆游离高丰度蛋白等污染物,干扰以质谱为代表的外泌体蛋白质组的分析结果。华盈视角强烈推荐科研人员通过qEV(尺寸排阻法)提取血浆外泌体,这样可以有效去除高丰度蛋白的污染(Wallis et al. J Extracell Vesicles. 2021;10:e12041.),提高外泌体蛋白质组的鉴定效率和准确性


2. 因为前期研究发现了很多相关的下游功能分子,所以研究者分别验证了外泌体对这些蛋白的调控作用,最终绘制了一条完整的信号通路。外泌体下游的深度研究是揭示外泌体作用的关键环节,但是我们不可能总是像这篇文章的思路一样可以精准的查阅到下游的功能蛋白和信号分子,所以需要更合理和有效的技术去筛选和挖掘下游的分子和通路,那么怎样去筛选这些分子和信号通路呢?我们推荐研究人员在信号通路确定阶段可以利用广谱磷酸化抗体芯片技术对外泌体处理后的受体细胞开展信号通路的筛选,这样可一次性对多条信号通路进行同步筛选,省时、高效,对于发现外泌体作用后激活的细胞信号通路乃至信号网络都能起到事半功倍的效果。
华盈生物目前已经形成了一套更完善、更专业、更具特色的外泌体科研服务体系,涵盖外泌体的分离、鉴定、组学分析(蛋白质组/转录组/miRNA/lncRNA)、外泌体标记和示踪、深度的下游机制分析(20K芯片筛互作蛋白、磷酸化抗体芯片筛信号通路)等。华盈生物以更专业的服务品质和更完善的服务体系助力大家更好的开展外泌体功能研究。


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华盈生物作为外泌体服务领域的专家,拥有独特的系统性服务优势,可实现外泌体研究的“一站式服务”。华盈生物的外泌体服务产品也基本扩展到了外泌体研究的方方面面(红色为华盈生物特色服务),包括:外泌体的三项鉴定(电镜、WB、NTA)、外泌体蛋白组筛选(label free、DIA、PRM、MRM)、外泌体核酸筛选(miRNA、RNA全转录组)、外泌体纳米流式检测、外泌体电转(药物分子、核酸)、外泌体细胞&动物功能实验(PKH26/DiO/量子点、荧光示踪)等。

参考文献

 Vicencio JM, Yellon DM, Sivaraman V, Das D, Boi-Doku C, Arjun S et al. Plasma exosomes protect the myocardium from ischemia-reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 2015;65(15):1525-36. (IF=20.589)  

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