文献赏析

华盈视角:祛湿化瘀汤对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗机制研究

2020/01/19

        非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)通常与肥胖、糖尿病和血脂异常等代谢合并症相关,随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势,非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因,普通成人NAFLD患病率10%~30%,其中50%的人会进一步发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH),后者10年内肝硬化发生率高达25%,最终甚至可能发展为肝癌。

        而NASH是NAFLD发展到肝纤维化甚至其它终末期肝病的一个重要中间步骤,目前尚无药物正式获批用于NASH的治疗。中国传统中药祛湿化瘀汤(QHD),目前已有报道,其对NASH拥有改善作用,但具体的机理尚不明确。2020年1月,华盈生物合作伙伴上海中医药大学附属曙光医院彭景华教授团队在《Phytomedicine》上发表了关于中药复方——祛湿化瘀汤治疗NASH的高质量研究文章。该研究探讨了QHD对NASH小鼠模型的肠道菌群、肠黏膜屏障功能及潜在调节信号通路的影响。并阐述了QHD通过抑制MAPK通路的激活进而抑制细菌脂多糖(LPS)对肠道和肝脏损伤导致NASH发生的药物治疗机理。本文为更广泛的NASH治疗药物的开发、改进优化和广泛应用打下了基础。 

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研究背景:

      在NASH的多种发病机制中,越来越多的人认识到肠道微生物群的失调参与了NASH的发生和发展。肠粘膜屏障功能的特点是紧密连接的完整性,会受不同信号通路的串扰调节,而革兰氏阴性细菌的细胞壁成分--脂多糖(LPS),已被证明可促进肠上皮损伤,导致肠漏和肝脏内LPS信号的启动,进而引起炎症,是导致NASH的重要因素。



模型建立及评估:

        为了探讨QHD的具体治疗机制,研究者将小鼠随机分为四组进行喂养:1. control组(n=9,普通饲料喂养);2. 高脂饮食(HFD)组(n=9,HFD喂养);3. QHD组(n=9,HFD喂养12周后灌喂QHD);4. NaB组(n=9,HFD喂养12周后灌喂丁酸钠(NaB)作为阳性对照组)。

        首先对模型进行评估,肝组织染色结果发现,在16周的HFD喂养中,观察到肝细胞表现出严重的脂肪变性,表现为H&E染色呈现气球状变性,而在QHD和NaB改善了高脂饮食引起的这种肝脏组织学变化。(见图1)

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图1  肝组织切片H&E染色电镜图


        另外研究者也从体重和肝损伤参数,包括非酒精性脂肪肝(NAFLD)活动评分、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肝甘油三酯(TG)这几个指标来观察模型的表现,发现QHD和NaB组都具有良好的治疗效果,见图2。

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图2 QHD对非酒精性脂肪性肝炎相关指标的调节



机理探索与构建:

        在明确了表型后,作者首先进行了16SrRNA测序,分析了肠道菌群的多样性,发现虽然QHD逆转了HFD饲养所改变的8种菌属,但进一步研究已鉴定的革兰氏阴性菌(LPS的来源)的总丰度,发现与对照组相比,HFD喂养小鼠的革兰氏阴性菌丰度增加,但无统计学意义;QHD组革兰阴性菌的数量与HFD组相比无明显变化,甚至高于对照组。肠道菌群测序结果说明,QHD并没有通过调控肠道中LPS来源的菌种数量来降低LPS的水平。

        然而通过RT-PCR检测的肠道紧密性相关基因的mRNA表达量变化可以看到,QHD组和NaB组相比于HFD组实现了回调,见图3。既然不是通过减少损伤物质的来源起作用,那么QHD很可能是通过对肠道的紧密性起到了保护和修复作用,进而实现其治疗效用的。

 

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图3 QHD对肠道紧密性相关基因mRNA表达调节

        那么药物到底是如何影响肠道紧密性的呢?

        中药本身具有多靶点的特性,中药复方的机理研究更是难度重重。面对中药复方可能调控的复杂信号通路网络,研究人员与华盈生物合作,采用了PEX100磷酸化抗体芯片技术,对小鼠结直肠组织中的31条信号通路磷酸化水平进行广泛筛选。抗体芯片结果显示,不论是模型组比空白组,还是给药组比模型组,MAPK通路的变化均最为显著,见图4。


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图4 QHD对肝组织信号通路磷酸化水平的调节


        而根据以往的报道,MAPK途径也确实与LPS的刺激调节紧密相关。作者根据抗体芯片结果,快速锁定了复杂的MAPK通路上几个关键的调变蛋白和磷酸化位点,并通过Western bot验证发现,与芯片结果一致,JNK、ERK1/2和MYPT1的磷酸化水平在LPS诱导后明显上调,而在QHD的作用下发生下调。见图5。

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图5  QHD对MAPK通路关键蛋白的调节 


        同时,对小鼠结肠切片中的ZO-1(肠道紧密性相关指标)和p-MYPT1(MAPK通路成员)进行免疫荧光染色,电镜观察显示:LPS刺激后,小鼠结肠中ZO-1信号变弱,pMYPT1信号变强,说明肠道通透性增加,肠道出现损伤;QHD可通过恢复ZO-1蛋白的表达,抑制pMYPT1的磷酸化,最终改善肠道紧密性,见图6。

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图6 结直肠组织免疫荧光染色



分析与展望:

        中药方剂是中医治病的基础,是中医学的核心,很多名方古方,经过上千年的临床实践验证,其疗效得到了医生和病人的广泛认可。然而,在高质量的SCI杂志中关于中药复方的机理与临床观察相关研究报道均屈指可数。

        华盈视角认为可能有以下几个主要原因:

        1. SCI科学体系的基础是要求可重复性,中医复方制剂的标准化成为主要门槛。本文采用的祛湿化瘀汤(QHD)是商品化产品,具有国家发明专利(ZL200610009140.0.0),其药物间的配伍比例与药用成分的提取,均做到了标准化,因此具备了发表SCI文章的前提。

        2. 中药多靶点的特点与机理的复杂性,是制约中药复方开展深入研究又一瓶颈。本研究中选取的高脂诱导的NASH动物模型,具有广泛的认可度,由于是代谢性疾病,对于肠道菌群与肝脏炎性调控的联合分析,既符合现代科学的基本认知,又兼顾了中药机理的复杂性与系统性。

        3. 信号通路是大多数药物机理研究的主要抓手,中药复方对实体组织和细胞的信号通路调控一定是复杂的。传统的研究方案仅仅通过前人报道,选取个别信号通路和蛋白质,利用RT-PCR或者Western blot进行检测,很难获得全面的有说服力的结果,与中药的复杂性不能匹配。而采用网络药理学等生物信息手段,分析出的药物调控通路又没有广泛的实验证据的验证支持,这些问题都制约了中药复方研究在SCI杂志中的发表频率。

        本研究中,作者选用了PEX100磷酸化信号通路广谱筛选抗体芯片,对大多数经典信号通路均进行了系统筛选,数据具有广泛性和说服力。通过数据分析发现的MAPK通路参与到NASH的形成,符合经典的病理学认知。研究阐述了祛湿化瘀汤(QHD)通过调控MAPK通路关键蛋白的磷酸化变化最终治疗NASH的结论,理论依据充分,数据广泛也具有针对性,符合SCI科学体系的基本逻辑。

        综上,华盈视角呼吁广大中医药研究人员,从本研究中吸取精华,努力能满足以上3个条件,一定会有更多优秀的中药复方文章出现在高质量的SCI杂志中。


英文链接:

Amelioration of non-alcoholic steatohepatitis by Qushi Huayu decoction is associated with inhibition of the intestinal mitogen-activated protein kinase pathway