文献赏析

华盈视角:蛋白芯片应用于肿瘤增殖研究

2018/07/27

       

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        2015年,美国斯坦福大学的Michelle Monje教授带领的研究小组通过二维电泳结合TMT标记定量蛋白质组学技术,成功发现了链接大脑皮层神经元活动与高分级胶质瘤(high-grade gliomas,HGG)生长之间的驱动基因——分泌蛋白NLGN3(Neuroligin-3)。并证实神经元活动可引起NLGN3的剪切和分泌增加,进一步导致PI3K-mTOR通路激活,引起HGG生长加快的现象。该研究第一次将肿瘤发生发展与神经元活动建立了联系,相关数据发表在当年的Cell杂志上(PMID: 25913192)。

       时隔2年多,Monje教授又利用磷酸化抗体芯片技术找到了NLGN3促进HGG生长的关键通路SHC-RAS-RAF-MEK-ERK信号通路,成功解释了NLGN3作为驱动基因如何调控HGG增殖的明确机理。同时也找到了NLGN3剪切分子金属蛋白酶ADAM10,为靶向治疗HGG提供了具有前景的治疗方案。该研究工作又在国际顶级期刊Nature杂志上引起业界瞩目(PMID: 28959975)。让国内读者不禁感叹,大牛发文章就是有诀窍,只有想不到,没有做不到。

 

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精彩文章解析见下文:

  • NLGN3促进高分级胶质瘤增殖

       研究人员从高分级胶质瘤(HGG)患者体内提取了肿瘤细胞,并将其注入到正常小鼠和NLGN3敲除小鼠的脑中。结果发现肿瘤在正常小鼠脑内快速生长,而NLGN3敲除小鼠中,癌细胞虽然依旧存在,但是生长扩散很慢,肿瘤长时间处于停滞生长的状态。在移植4.5个月后,一些小鼠体内的肿瘤克服它们对NLGN3的依赖性而开始生长,见图1。此外,研究人员也尝试将人乳腺癌细胞移植到NLGN3敲除小鼠大脑中,发现乳腺癌生长并未受到影响,证实NLGN3对高分级神经胶质瘤的影响具有保守性。

 

 

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图1 NLGN3促进高分级胶质瘤增殖


 

  • NLGN3通过激活多条信号通路促进肿瘤增殖

        根据2015年的研究,NLGN3可以通过调节PI3K-mTOR信号影响肿瘤增殖。为进一步探讨NLGN3的作用机制,研究人员对NLGN3可能参与影响的其他信号通路情况进行了系统性分析。应用信号通路磷酸化广谱筛选PEX100(一次芯片实验即可完成胞内31条信号通路磷酸化调变的全谱筛选),研究人员对用NLGN3刺激5分钟和30分钟的胶质瘤细胞进行了信号通路磷酸化的检测。

        芯片结果显示NLGN3可以激活多种促进肿瘤的信号通路,主要包含早期响应的核心因子FAK以及下游的SRC,PI3K–mTOR和SHC-RAS-RAF-MEK-ERK信号通路的活化。一旦抑制FAK,肿瘤增殖也会受到显著抑制,见图2。上述结果为分泌蛋白NLGN3如促进肿瘤增殖的下游效应机制画上了完整的句号。

 

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图2 NLGN3通过激活多条信号通路肿瘤增殖

 

  • ADAM10是介导NLGN3切割成熟和脱落的关键蛋白酶

         那么,是什么原因导致NLGN3蛋白从神经元等细胞中分泌和切割成熟的呢?

       全长NLGN3会被酶切成活性形式并得以分泌,为确定参与剪切过程的蛋白酶,研究人员通过网站(https://prosper.erc.monash.edu.au/home.html)预测分析酶切位点,发现MMP和ADAM家族是可能发挥剪切作用的关键蛋白酶。应用蛋白酶抑制剂进行后续分析,证实MMP9和ADAM10是介导NLGN3剪切成熟的关键蛋白酶。鉴于MMP9敲除小鼠并未影响到NLGN3的分泌,而ADAM10敲除小鼠导致NLGN3分泌水平下降了近一半,因此研究人员得出结论:ADAM10是NLGN3切割脱落的主要蛋白酶,见图3。

 

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图3 ADAM10是介导NLGN3切割成熟和脱落的关键蛋白酶

 

  • ADAM10抑制剂阻断了胶质瘤增殖

         ADAM10是否会成为HGG治疗新的靶点呢?

      研究人员分析了ADAM10抑制剂对HGG增殖的影响。一旦应用ADAM10抑制剂处理胶质瘤细胞,即可显着降低注入大鼠脑部胶质瘤的生长,如图4。可喜的是,ADAM10/17抑制剂作为针对大脑之外的其他癌症类型的一种潜在化疗药物已进入II期临床试验,因此应用ADAM10抑制剂阻断NLGN3的释放也不失为胶质瘤治疗的新策略。但本研究也指出,尽管针对ADAM10和NLGN3的治疗可能延长患者的寿命,但它们不会杀死肿瘤,因此后期还是需要结合其它治疗手段来帮助治疗。

 

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图4 ADAM10抑制剂阻断了胶质瘤增殖

 

小结:

       近十年来,微环境研究是肿瘤研究领域里最炙手可热的研究方向,而分泌型蛋白在肿瘤微环境形成过程中起着至关重要的作用。本文通讯作者Michelle Monje教授的研究团队先通过定量蛋白组学技术找到了胶质瘤微环境蛋白NLGN3,并利用磷酸化抗体芯片技术发现了NLGN3不同时间点调控的信号通路,完整解释了NLGN3调控胶质瘤增殖的明确机制。串联Michelle Monje教授在Cell和Nature上发表的两篇高质量研究文章,我们不难发现作者分两步走的研究思路:第一步,发现并证实微环境蛋白;第二步,解释微环境机理,找到潜在药靶。

        同时,我们也可以发现蛋白组学技术(质谱和抗体芯片)在微环境研究领域的作用已经成为必不可少的技术,将为更多的优秀科学发现和科研工作提供新的技术路线和动力。

英文文献链接:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Targeting+neuronal+activity-regulated+neuroligin-3+dependency+in+high-grade+glioma.