文献赏析

华盈视角:甲基化研究新套路

2018/06/01

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        组蛋白甲基化研究与表观调控是肿瘤机制研究中的重要方向,然而传统甲基化研究一般分四步走:寻找甲基化位点、分析甲基化位点与生物表型相关性、验证甲基化调控靶基因表达量变化、构建转录层面调控机制。

为更深入探索表观调控与临床现象间的具体机制,上海华盈生物合作伙伴——华中科技大学同济医院马丁院士课题组以高分化恶性卵巢癌(HG-SOC)对顺铂耐药为研究对象,为组蛋白甲基化和表观调控提供了新的研究典范,相关研究成果近期发表在国际顶级学术期刊《Nature Communications》上。

 

文献解读

1、组蛋白甲基化,发现关键基因C/EBPβ

在HG-SOC组织中,研究人员应用ChIP-seq技术对H3K4、H3K36、H3K79(转录激活相关)和H3K9、H3K27、H4K20(转录抑制相关)六个甲基化位点进行基因层面的分析,结果显示HG-SOC中许多基因的H3K79甲基化上调,并在IHC实验中得到证实。RNA-seq结果表明HG-SOC中上调的基因与H3K79高甲基化相关,说明H3K79甲基化对于调控基因表达发挥重要作用。

进一步,利用生信软件HOMER,研究人员找到与组蛋白甲基化相关的35个转录因子,其中CEBPB(编码C/EBPβ蛋白)与H3K79甲基化上调成最显著相关性,见图1。

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图1 HG-SOC表观遗传重编程转录因子

  
2、C/EBPβ高表达促进卵巢癌对顺铂耐药

目前卵巢癌患者在临床治疗中遇到的主要障碍是耐药性,导致患者预后较差。而C/EBPβ在不良预后病人中高表达,因此研究人员推测C/EBPβ与卵巢癌对顺铂耐药相关。

利用TCGA数据库和IHC实验,对C/EBPβ和卵巢癌病人的顺铂耐药可能性进行评估,结果显示高表达的C/EBPβ与顺铂耐药正相关。应用C/EBPβ基因过表达和敲降技术,在细胞实验和动物实验同步证实:C/EBPβ过表达促进顺铂耐药,而敲降C/EBPβ可以降低顺铂耐药。此外,临床卵巢癌患者在顺铂治疗后,肿瘤组织中的C/EBPβ蛋白表达水平也有明显上调,如图2。

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图2  C/EBPβ与顺铂抗性分析

 
3、C/EBPβH3K79甲基化调控

根据ChIP-seq实验结果显示,敲降C/EBPβ可以导致H3K79甲基化水平下调,进而可导致H3K79调控基因表达下调。研究人员在两种不同的卵巢癌细胞系中分别敲降C/EBPβ并检测H3K79的甲基化水平。通过RNA-seq分析,发现C/EBPβ敲降后,1238个基因发生上调,504个基因发生下调,其中9个与顺铂抗性相关基因的表达水平伴随着H3K79甲基化的下调而降低。IPA分析显示这些基因主要参与到顺铂抗性相关的DNA损失修复(DDR)信号和ERK5信号中,如图3。

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图3  C/EBPβ调节H3K79甲基化重编程基因表达

 
4. 发现C/EBPβ调控H3K79甲基转移酶DOT1L

根据ChIP-seq实验结果,C/EBPβ靶向基因与DOT1L靶向基因具有显著相关性,并且C/EBPβ结合位点与DOT1L结合位点距离接近,两者有物理相互作用。经过ChIP-qPCR验证结果进一步证实,C/EBPβ通过增强DOT1L结合能力调节H3K79甲基化。应用DOT1L抑制剂或shRNA进行体内外抑制实验,发现DOT1L抑制后,C/EBPβ高表达引起的顺铂耐药性也随之降低,见图4

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图4  C/EBPβ通过DOT1L调节H3K79甲基化

  
5、蛋白芯片:搭建甲基转移酶与耐药现象的桥梁

对于大多数甲基化研究者来说,能找到发挥显著生物功能的甲基转移酶已实属不易。甲基化作为表观调控的经典方式,对生物表型的调控一般是通过对靶基因的转录调控实现的。然而,靶基因mRNA的表达与生物表型间还存在着巨大的gap。如何迅速在找到能够承接甲基转移酶与生物表型间的蛋白或蛋白修饰功能分子?蛋白芯片技术可以完美对接...
       在本研究中,为进一步探讨C/EBPβ-DOT1L引起顺铂耐药的详细机制,研究人员检测DOT1L敲降后的23个C/EBPβ-DOT1L共调控靶基因,发现它们的表达均降低。而这其中就包括已证实的信号通路调控分子RICTOR (AKT-mTOR)、SLC38A1(AKT)、OSMR(STAT3)、LDLR(ERK)和HIF1A(EGFR)等。如果能够证实EGFR、PI3K-AKT、JAK-STAT3、ERK等信号通路同步也受到抑制,C/EBPβ-DOT1L表观调控与卵巢癌对顺铂耐药的机理就得以完美解释。
        面对复杂的信号通路筛选,研究人员果断采用信号通路磷酸化广谱芯片PCS248(一次芯片实验即可完成12条信号通路磷酸化调变筛选),对C/EBPβ敲降组和对照组JAK-STAT、PI3K-AKT、MAPK等12条肿瘤通路进行广泛分析,快速证实了自己提出的假说,为C/EBPβ-DOT1L促顺铂耐药机理的探索画上完美句号,即C/EBPβ与DOT1L形成复合物调控靶基因表达,进而促进肿瘤增殖和转移相关通路的活化导致临床常用化疗药物顺铂在卵巢癌的治疗过程中发生耐药,见图5 

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图5  C/EBPβ引起顺铂抗性信号机制


小结:

该研究采用了经典的甲基化研究思路,找到了甲基转移酶复合物C/EBPβ-DOT1L在卵巢癌顺铂耐药中发挥作用,通过蛋白芯片技术揭开了表观调控与肿瘤耐药之间的黑匣子,找到了明确的耐药机制,为甲基化调控深入研究提供了典范。

 
英文文献链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=C%2FEBP%CE%B2+enhances+platinum+resistance